基于timsTOF fleX的深度空間代謝組學解決方案
ASMS Poster# 布魯克創新方案
MALDI 成像與傳統代謝組學相結合
實現全景式分子信息表征
1前言
細胞是疾病的基礎,組織的質譜分析為了解細胞內發生的變化提供了最直接、最靈敏的途徑。常見的LC-MS組學分析技術需要先將樣本做勻漿處理,然而,樣本被勻漿后檢測,會丟失待測分子的空間位置信息。質譜成像是一種原位分析技術,它可以直接從組織中獲得上千種分子的空間分布信息。為了彌補組織勻漿法的不足,布魯克公司綜合上述技術的優勢,率先推出了SpatialOMx?深度空間組學實驗方案。首先借助 timsTOF fleX質譜儀的MALDI成像功能來識別并定位組織切片中的特定區域(ROI),再針對該區域、通過timsTOF fleX連接UPLC進行更加深入的4D-組學表征。圖1展示了SpatialOMx?的工作流程示意圖。
2實驗方法
制備冷凍的大鼠鼠腦組織切片(厚度10μm),附著到IntelliSlides?導電載玻片上,然后噴涂DHAP基質。通過布魯克timsTOF fleX質譜儀以50μm的空間分辨率,在正離子模式下對鼠腦樣本進行MALDI質譜成像數據采集。SCiLS??Lab 2023a和MetaboScape??2023a軟件分別用于成像數據的統計分析和分子注釋。首先,成像數據通過SCiLS?Lab 2023a軟件進行無監督的統計分析—空間聚類分析,劃分為不同的區域,此次實驗劃分為兩個區域(圖2B),用于后續的組學實驗。結合上述的區域劃分結果,從一片連續的腦切片沿著邊界進行切割、分別獲取了圖2B中兩個區域所對應的組織。分別對兩部分組織進行脂質分子提?。河?00μL叔甲基丁基、80μL甲醇和200μL超純水組成的提取緩沖液進行提??;渦旋,超聲處理10min;3000rpm離心10min,取200μL上清液;然后用真空干燥器干燥約10min;最后用9:1的甲醇:二氯甲烷的混合溶液進行重懸。LC-MS分析實驗條件:Intensity solo2 C18色譜柱(100x2.1mm),流動相A(乙腈:水:1M甲酸銨=600:390:10,添加0.1%甲酸),流動相B(異丙醛:乙腈:1M甲酸銨=900:90:10,添加0.1%甲酸),進樣10μL。質控是通過對整片腦組織切片進行提取、處理,上樣不同的體積,以此來確定各種脂質種類的檢測限。
3實驗結果與討論
SCiLS?Lab 2023a對大鼠鼠腦的成像數據進行空間聚類分析,可以劃分成藍色和黃色兩個區域,如圖2B所示,分別對應腦灰質和腦白質。
將藍色和黃色的區域分別切割下來,提取脂質后分別進行LC-MS/MS組學分析,獲取了精確質量數、MS/MS以及碰撞截面積(CCS)值等信息,并通過MetaboScape 2023a軟件進行了feature提取和分子信息標注。一共提取并標注了600個特征峰,對其中的11個脂質類別中的約100種脂質,采用Rule-based Lipid Annotations進行脂質注釋,注釋結果如圖3所示。
針對目標分子采集二級質譜數據,將獲得的MS/MS譜圖與NIST 2020 MS/MS數據庫進行比對,以HexCer 18:1;O2/24:1為例,比對結果如圖4所示。
實驗總共進樣22次,包括5次空白對照,5次質控,以及從連續切片的腦組織中經過切割分別獲得的兩組組織樣本(藍色區域和黃色區域),每組各做了3次平行實驗。結果如圖5所示,左圖為每個樣本單獨進樣的峰強度值,右圖為空白對照、質控、藍色區域和黃色區域樣本間的組別分析。
通過MALDI質譜成像獲得的HexCer 18:1;O2/24:1的空間分布圖像如圖6所示,HexCer 18:1;O2/24:1主要分布在腦白質區域。該結果與圖5中經過LC-MS/MS組學分析所獲得的含量趨勢是一致的。
4結論
布魯克的timsTOF fleX質譜儀同時具備MALDI成像功能和LC-MS/MS組學分析功能,可以在同一臺儀器上實現空間組學工作流程中的兩大核心步驟。本文以大鼠鼠腦作為實驗樣本,通過MALDI成像實驗,在空間上指導發現特定目標區域,并針對該區域進行深度4D-組學分析;配合SCiLS Lab和MetaboScape軟件的使用,實現了生物分子的多維度、全景式空間信息表征。
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